Spektrofotometri su postali rutinski instrumenti u modernim laboratorijima molekularne biologije. Često se koristi za nukleinske kiseline, kvantifikaciju proteina i kvantifikaciju koncentracija bakterijskog rasta.
Jednostavan princip spektrofotometra
Spektrofotometar koristi izvor svjetlosti koji može generirati višestruke valne duljine i prolazi kroz niz spektroskopskih uređaja kako bi generirao izvor svjetla određene valne duljine. Nakon što izvor svjetlosti prođe kroz uzorak koji se ispituje, dio izvora svjetlosti se apsorbira i izračunava se apsorbancija uzorka, čime se pretvara u koncentraciju uzorka. , Apsorbancija uzorka proporcionalna je koncentraciji uzorka.
Kvantifikacija nukleinskih kiselina
Kvantifikacija nukleinskih kiselina je najčešće korištena funkcija spektrofotometra. Oligonukleotidi, jednolančana, dvolančana DNA i RNA mogu se kvantificirati u puferu. Vrh apsorpcije najviše apsorpcijske maksimuma nukleinske kiseline je 260 nm. Molekularni sastav svake nukleinske kiseline je različit, pa su faktori konverzije različiti. Za kvantificiranje različitih tipova nukleinskih kiselina, odaberite odgovarajuće koeficijente unaprijed. Na primjer, apsorbancija od 1 OD odgovara 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA i 30 μg / ml Olig. Apsorbancija nakon ispitivanja pretvara se pomoću gornjih koeficijenata kako bi se dobila odgovarajuća koncentracija uzorka. Prije ispitivanja, odaberite ispravan postupak, unesite volumen temeljne otopine i razrjeđivača, a zatim ispitajte slijepu i uzorak otopinu. Međutim, eksperiment nije uvijek bio glatka. Nestabilna čitanja mogu biti najveća glavobolja za eksperimentatora. Instrumenti s većom osjetljivošću pokazuju veći pomak apsorbancije.
Zapravo, princip konstrukcije i princip rada spektrofotometra dopuštaju apsorbanciju da varira unutar određenog raspona, tj. Instrument ima određenu točnost i preciznost. Na primjer, točnost Eppendorf Biophotometera je <1,0%> Rezultati takvih višestrukih ispitivanja variraju između oko 1,0% srednje vrijednosti i normalni su. Osim toga, potrebno je uzeti u obzir i fizikalno-kemijska svojstva same nukleinske kiseline i pH pufera u kojem je otopljena nukleinska kiselina, koncentracija iona i sl.: Kada je koncentracija iona previsoka za vrijeme ispitivanja, čitanje pomiče, pa se preporučuje uporaba određene pH vrijednosti i niske koncentracije iona. Puferi, kao što je TE, uvelike stabiliziraju očitanja. Koncentracija razrjeđenja u uzorku također je faktor koji se ne može zanemariti: zbog neizbježne prisutnosti nekih finih čestica, posebno uzoraka nukleinskih kiselina, u uzorku. Prisutnost tih malih čestica ometa rezultate ispitivanja. Da bi se smanjio učinak čestica na rezultate ispitivanja, apsorpcija nukleinske kiseline mora biti najmanje veća od 0.1 A, a apsorbancija je poželjno između 0.1 i 1.5 A. U tom rasponu, interferencija od čestice su relativno male i rezultat je stabilan.
To znači da koncentracija uzorka ne smije biti preniska ili previsoka (izvan ispitnog područja fotometra). Konačno, radni faktori, kao što je miješanje, trebali bi biti dovoljni, inače je vrijednost apsorbancije preniska, čak i negativne vrijednosti; mješavina ne može postojati mjehuriće, prazna tekućina nema suspendiranu tvar, inače čitanje drastično pada; za testiranje slijepog uzorka i uzorka treba koristiti istu kivetu. Inače je razlika u koncentraciji prevelika; faktor konverzije i jedinica koncentracije uzorka se biraju dosljedno; ne može se koristiti kiveta s habanjem prozora; volumen uzorka mora doseći minimalnu količinu koju zahtijeva kiveta.
Pored koncentracije nukleinske kiseline, spektrofotometar također pokazuje nekoliko vrlo važnih omjera koji ukazuju na čistoću uzorka, kao što je omjer A 260 / A 280, korišten za procjenu čistoće uzorka jer je apsorpcijski pik proteina 280 nm. Čisti uzorak s omjerom većim od 1,8 (DNA) ili 2,0 (RNA). Ako je omjer manji od 1,8 ili 2,0, to ukazuje na prisutnost proteina ili fenolnih tvari. 230 pokazuje da su neki kontaminanti prisutni u uzorku, kao što su ugljikohidrati, peptidi, fenoli itd., A omjer čišće nukleinske kiseline A 260 / A 230 je veći od 2.0. A 320 detektira zamućenost otopine i druge faktore interferencije. Za čiste uzorke, A 320 je općenito 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co, Ltd
Dodati: No.168 Wuchang Ave., Yuhang Distrikta, Hangzhou 310023, Kina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com